蛋白質(zhì)的分離和純化
分離、純化蛋白質(zhì)是研究單個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的先決條件。通常利用蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，采取不損傷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的物理方法來純化蛋白質(zhì)。
1．分離和純化概述 分離、純化方法
蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)
機(jī)理
透析、超濾法
蛋白質(zhì)屬于大分子
①透析是利用透析袋將大分子蛋白質(zhì)和小分子化合物分開
②超濾法是利用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截 留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的
丙酮沉淀、鹽析
蛋白質(zhì)顆粒表面有水化
膜、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)
向溶液中加入脫水劑破壞水化膜使蛋白質(zhì)沉淀而分離
將溶液pH調(diào)節(jié)至蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，消除其電荷
電泳
蛋白質(zhì)顆粒表面帶電荷
帶電荷的蛋白質(zhì)分子在電場中向正極或負(fù)極泳動而使蛋白質(zhì)分離
層析
蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷
多少、親和力
離子交換層析、親和層析、凝膠過濾
超速離心
蛋白質(zhì)分子量大小
既可分離純化蛋白質(zhì)，又可測定蛋白質(zhì)分子量
2．丙酮沉淀、鹽析和免疫沉淀
蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離，否則蛋白質(zhì)會變性。
鹽析是指在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽(如氯化鈉、硫酸鈉、硫酸銨)，使蛋白質(zhì)沉淀。鹽析一般無蛋白質(zhì)的變性。
蛋白質(zhì)具有抗原性，將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白，稱免疫沉淀法。
3．電泳利用蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)的特性來分離各種蛋白質(zhì)。分子量小，帶電多的蛋白質(zhì)泳動速率快。
4．透析利用透析袋將大分子的蛋白質(zhì)與小分子化合物分開。
5．層析利用蛋白質(zhì)的電荷量和性質(zhì)不同，通過離子交換層析，或親和層析將蛋白質(zhì)分開。如使用陰離子交換層析，由于陰離子交換樹脂顆粒上帶正電荷，能吸引溶液中的陰離子。然后用含陰離子的溶液洗柱。含負(fù)電荷小的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來；增加陰離子濃度，含負(fù)電荷多的蛋白質(zhì)也被洗脫下來，于是兩種蛋白質(zhì)被分開。
6．分子篩也稱凝膠過濾，是利用分子大小分離蛋白質(zhì)的方法。
7．超速離心利用蛋白質(zhì)的密度、形態(tài)、沉降系數(shù)不同而分離蛋白質(zhì)。注意：①利用蛋白質(zhì)兩性性分離蛋白質(zhì)的有——電泳、離子交換層析。 ②利用蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)的有——透析、分子篩(凝膠過濾層析)。
【例29】2000N020A下列蛋白質(zhì)通過凝膠過濾層析時(shí)最先被洗脫的是
A．馬肝過氧化氫酶(分子量247500)
B．肌紅蛋白(分子量16900)
C．人血清清蛋白(分子量68500)
D．牛β－乳球蛋白(分子量35000)
E．牛胰島素(分子量5733)
【例30】1993N020A用凝膠過濾層析(交聯(lián)葡聚糖凝膠)柱分離蛋白質(zhì)時(shí)，下列哪項(xiàng)是正確的?
A．分子體積的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
B．分子體積最小的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
C．不帶電荷的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
D．帶電荷的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
E．沒有被吸附的蛋白質(zhì)最先洗脫下來 解題：①分子篩(凝膠過濾層析)是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行的分離提純。是在層析柱內(nèi)充滿帶小孔。 的顆粒，蛋白質(zhì)溶液加入柱的上部，讓其自然下滲。這時(shí)，小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠微孔，大分子不能 進(jìn)入先洗脫下來，小分子后洗脫下來。并不是想當(dāng)然的小分子由于濾過快，先洗脫下來。
②離子交換層析，是以蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同進(jìn)行的分離提純。若以電荷考慮，對于陰離子交換 屢析，則合負(fù)電荷小的癆蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。
2．丙酮沉淀、鹽析和免疫沉淀
蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離，否則蛋白質(zhì)會變性。
鹽析是指在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽(如氯化鈉、硫酸鈉、硫酸銨)，使蛋白質(zhì)沉淀。鹽析一般無蛋白質(zhì)的變性。
蛋白質(zhì)具有抗原性，將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白，稱免疫沉淀法。
3．電泳利用蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)的特性來分離各種蛋白質(zhì)。分子量小，帶電多的蛋白質(zhì)泳動速率快。
4．透析利用透析袋將大分子的蛋白質(zhì)與小分子化合物分開。
5．層析利用蛋白質(zhì)的電荷量和性質(zhì)不同，通過離子交換層析，或親和層析將蛋白質(zhì)分開。如使用陰離子交換層析，由于陰離子交換樹脂顆粒上帶正電荷，能吸引溶液中的陰離子。然后用含陰離子的溶液洗柱。含負(fù)電荷小的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來；增加陰離子濃度，含負(fù)電荷多的蛋白質(zhì)也被洗脫下來，于是兩種蛋白質(zhì)被分開。
6．分子篩也稱凝膠過濾，是利用分子大小分離蛋白質(zhì)的方法。
7．超速離心利用蛋白質(zhì)的密度、形態(tài)、沉降系數(shù)不同而分離蛋白質(zhì)。
注意：①利用蛋白質(zhì)兩性性分離蛋白質(zhì)的有——電泳、離子交換層析。
②利用蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)的有——透析、分子篩(凝膠過濾層析)。
【例29】2000N020A下列蛋白質(zhì)通過凝膠過濾層析時(shí)最先被洗脫的是
A．馬肝過氧化氫酶(分子量247500)
B．肌紅蛋白(分子量16900)
C．人血清清蛋白(分子量68500)
D．牛β－乳球蛋白(分子量35000)
E．牛胰島素(分子量5733)
【例30】1993N020A用凝膠過濾層析(交聯(lián)葡聚糖凝膠)柱分離蛋白質(zhì)時(shí)，下列哪項(xiàng)是正確的?
A．分子體積的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
B．分子體積最小的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
C．不帶電荷的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
D．帶電荷的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
E．沒有被吸附的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
解題：①分子篩(凝膠過濾層析)是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行的分離提純。是在層析柱內(nèi)充滿帶小孔的顆粒，蛋白質(zhì)溶液加入柱的上部，讓其自然下滲。這時(shí)，小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠微孔，大分子不能進(jìn)入先洗脫下來，小分子后洗脫下來。并不是想當(dāng)然的小分子由于濾過快，先洗脫下來。
②離子交換層析，是以蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同進(jìn)行的分離提純。若以電荷考慮，對于陰離子交換屢析，則合負(fù)電荷小的癆蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。
參考答案：
29．A 30．A
分離、純化蛋白質(zhì)是研究單個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的先決條件。通常利用蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，采取不損傷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的物理方法來純化蛋白質(zhì)。
1．分離和純化概述 分離、純化方法
蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)
機(jī)理
透析、超濾法
蛋白質(zhì)屬于大分子
①透析是利用透析袋將大分子蛋白質(zhì)和小分子化合物分開
②超濾法是利用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截 留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的
丙酮沉淀、鹽析
蛋白質(zhì)顆粒表面有水化
膜、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)
向溶液中加入脫水劑破壞水化膜使蛋白質(zhì)沉淀而分離
將溶液pH調(diào)節(jié)至蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，消除其電荷
電泳
蛋白質(zhì)顆粒表面帶電荷
帶電荷的蛋白質(zhì)分子在電場中向正極或負(fù)極泳動而使蛋白質(zhì)分離
層析
蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷
多少、親和力
離子交換層析、親和層析、凝膠過濾
超速離心
蛋白質(zhì)分子量大小
既可分離純化蛋白質(zhì)，又可測定蛋白質(zhì)分子量
2．丙酮沉淀、鹽析和免疫沉淀
蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離，否則蛋白質(zhì)會變性。
鹽析是指在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽(如氯化鈉、硫酸鈉、硫酸銨)，使蛋白質(zhì)沉淀。鹽析一般無蛋白質(zhì)的變性。
蛋白質(zhì)具有抗原性，將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白，稱免疫沉淀法。
3．電泳利用蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)的特性來分離各種蛋白質(zhì)。分子量小，帶電多的蛋白質(zhì)泳動速率快。
4．透析利用透析袋將大分子的蛋白質(zhì)與小分子化合物分開。
5．層析利用蛋白質(zhì)的電荷量和性質(zhì)不同，通過離子交換層析，或親和層析將蛋白質(zhì)分開。如使用陰離子交換層析，由于陰離子交換樹脂顆粒上帶正電荷，能吸引溶液中的陰離子。然后用含陰離子的溶液洗柱。含負(fù)電荷小的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來；增加陰離子濃度，含負(fù)電荷多的蛋白質(zhì)也被洗脫下來，于是兩種蛋白質(zhì)被分開。
6．分子篩也稱凝膠過濾，是利用分子大小分離蛋白質(zhì)的方法。
7．超速離心利用蛋白質(zhì)的密度、形態(tài)、沉降系數(shù)不同而分離蛋白質(zhì)。注意：①利用蛋白質(zhì)兩性性分離蛋白質(zhì)的有——電泳、離子交換層析。 ②利用蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)的有——透析、分子篩(凝膠過濾層析)。
【例29】2000N020A下列蛋白質(zhì)通過凝膠過濾層析時(shí)最先被洗脫的是
A．馬肝過氧化氫酶(分子量247500)
B．肌紅蛋白(分子量16900)
C．人血清清蛋白(分子量68500)
D．牛β－乳球蛋白(分子量35000)
E．牛胰島素(分子量5733)
【例30】1993N020A用凝膠過濾層析(交聯(lián)葡聚糖凝膠)柱分離蛋白質(zhì)時(shí)，下列哪項(xiàng)是正確的?
A．分子體積的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
B．分子體積最小的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
C．不帶電荷的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
D．帶電荷的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
E．沒有被吸附的蛋白質(zhì)最先洗脫下來 解題：①分子篩(凝膠過濾層析)是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行的分離提純。是在層析柱內(nèi)充滿帶小孔。 的顆粒，蛋白質(zhì)溶液加入柱的上部，讓其自然下滲。這時(shí)，小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠微孔，大分子不能 進(jìn)入先洗脫下來，小分子后洗脫下來。并不是想當(dāng)然的小分子由于濾過快，先洗脫下來。
②離子交換層析，是以蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同進(jìn)行的分離提純。若以電荷考慮，對于陰離子交換 屢析，則合負(fù)電荷小的癆蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。
2．丙酮沉淀、鹽析和免疫沉淀
蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離，否則蛋白質(zhì)會變性。
鹽析是指在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽(如氯化鈉、硫酸鈉、硫酸銨)，使蛋白質(zhì)沉淀。鹽析一般無蛋白質(zhì)的變性。
蛋白質(zhì)具有抗原性，將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白，稱免疫沉淀法。
3．電泳利用蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)的特性來分離各種蛋白質(zhì)。分子量小，帶電多的蛋白質(zhì)泳動速率快。
4．透析利用透析袋將大分子的蛋白質(zhì)與小分子化合物分開。
5．層析利用蛋白質(zhì)的電荷量和性質(zhì)不同，通過離子交換層析，或親和層析將蛋白質(zhì)分開。如使用陰離子交換層析，由于陰離子交換樹脂顆粒上帶正電荷，能吸引溶液中的陰離子。然后用含陰離子的溶液洗柱。含負(fù)電荷小的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來；增加陰離子濃度，含負(fù)電荷多的蛋白質(zhì)也被洗脫下來，于是兩種蛋白質(zhì)被分開。
6．分子篩也稱凝膠過濾，是利用分子大小分離蛋白質(zhì)的方法。
7．超速離心利用蛋白質(zhì)的密度、形態(tài)、沉降系數(shù)不同而分離蛋白質(zhì)。
注意：①利用蛋白質(zhì)兩性性分離蛋白質(zhì)的有——電泳、離子交換層析。
②利用蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)的有——透析、分子篩(凝膠過濾層析)。
【例29】2000N020A下列蛋白質(zhì)通過凝膠過濾層析時(shí)最先被洗脫的是
A．馬肝過氧化氫酶(分子量247500)
B．肌紅蛋白(分子量16900)
C．人血清清蛋白(分子量68500)
D．牛β－乳球蛋白(分子量35000)
E．牛胰島素(分子量5733)
【例30】1993N020A用凝膠過濾層析(交聯(lián)葡聚糖凝膠)柱分離蛋白質(zhì)時(shí)，下列哪項(xiàng)是正確的?
A．分子體積的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
B．分子體積最小的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
C．不帶電荷的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
D．帶電荷的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
E．沒有被吸附的蛋白質(zhì)最先洗脫下來
解題：①分子篩(凝膠過濾層析)是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行的分離提純。是在層析柱內(nèi)充滿帶小孔的顆粒，蛋白質(zhì)溶液加入柱的上部，讓其自然下滲。這時(shí)，小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠微孔，大分子不能進(jìn)入先洗脫下來，小分子后洗脫下來。并不是想當(dāng)然的小分子由于濾過快，先洗脫下來。
②離子交換層析，是以蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同進(jìn)行的分離提純。若以電荷考慮，對于陰離子交換屢析，則合負(fù)電荷小的癆蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。
參考答案：
29．A 30．A